スカート着用の拒否が単なる嗜好のものなのか、それとも性自認などプライバシーに関するものなのかが分かりませんので、理由を強制的に求めることは問題がございます。
着用が定められた制服であること、また別に注文しなければいけないことから上司に報告が必要であること等、何故理由の確認が必要なのかを明確にして、あくまでも本人の同意のうえ可能な範囲で確認するにとどめるべきでしょう。

2020年6月より職場におけるパワーハラスメント防止対策が強化され、2022年4月からは中小企業にもハラスメント防止措置が義務付けられます。
私的なことに過度に立ち入ることはもちろん、性的指向・性自認や病歴、不妊治療等の機微な個人情報について、本人の了解を得ずに他の社員に暴露すること（アウティング）も、「個の侵害」として職場におけるパワハラに該当すると考えられます。
ただし、本人の了解を得て、その個人情報について、必要な範囲で関係部署（例：人事労務部門の担当者）に伝達し、配慮を促すことはパワハラに該当しないと考えられますので、理由を聞いた場合にはこの点にも十分ご注意ください。

今後の対策として、募集の段階で制服（スカート）の着用義務があることを明記しておくこと、あるいは既存の社員への影響も考えてパンツも選べるような制服に変更することもご検討されてはいかがでしょうか？